采用絮凝法来处理发酵液

212 发酵技木

1.0VVM.平均1:0.6VVM左右。发酵72h，酶活力一般达2500~3200U/mL,

酶的提取工业用的粗制品酶采用盐析法提取，将培养物滤去菌体，用盐酸调节至 pH4.0以下,加入硫酸铵至终浓度55%，静置过夜，倾去上清液，沉淀压滤去母液，于40℃烘干后磨粉，盐析工艺收率94%以上，干燥后收率60%以上，酶活力为20X10U/g.也可将发酵液滤除菌体后，使用刮板式薄膜蒸发器40℃浓缩至原来的1/4~1/3，直接作为商品。④酶的纯化供医药和食品工业使用的酶通常要进一步纯化。纯化方法有以下两种:离子交换法 将所得的粗酶加水浸泡(pH3.0)、过滤或直接将上述发酵液离心后，用55%硫酸铵盐析后压滤，再将酶泥溶于0.005mol/LpH2.5乳酸缓冲液中，用通用两性一号离子交换柯脂进行脱色(收率93%)，用真空薄膜刮板蒸发器于40℃浓缩至原来的1/2以上(收率90%)、再用732阳离子、701阳离子树脂混合床脱盐(收率90%)、最后进行喷雾干燥或冷冻干燥、磨粉即成，成品为淡黄至乳白色粉末，酶活力为40x10~60x10'U/g。

6.单宁酸沉淀法在搅拌下向发酵滤液(pH5.5左右)加入10%单宁酸，使单宁酸的终浓度在1%左右。静置1h，离心收集酶与单宁酸的复合物。再向此复合物中加人10%聚乙二醇(相对分子质量6000)，使聚乙二醇用量相当于原酶液的0.3%~0.5%，不断搅拌，离心去除单宁聚乙二醇聚合物，经此过程，酶液可以浓缩至原来的1/10，总收率90%以上，向浓缩液加人糖用活性炭3%(在pH4.5左右)脱色，得到浅黄脱色酶液，酶回收率90%~95%，脱色酶液或用酒精在低温下沉淀，或用硫酸铵盐析制成浅色酶粉，其活力可达40x10°~60X10U/g,总收率在70%以上,

2.中性蛋白酶生产

我国生产中性蛋白酶的菌种主要是枯草杆菌AS114、1.398、172，栖土曲霉3.94等。以下以枯草杆菌AS1.398液体深层培养法为例介绍中性蛋白酶的生产技术。

(1)工艺流程如图9-54所示，

料面菌种 种子培养 发酵 盐析

包装 烘干 压榨 过滤

图9-54中性蛋白酶生产工艺流程

(2)操作要点

①菌种培养培养基使用牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基，牛肉膏1%、蛋白胨 1%、琼脂2%、氯化钠0.5%，pH6.7~7.0，高压蒸汽灭菌。制好斜面培养基接种后，菌种在 30℃

下养26h，于0~5℃冰箱保存。

种子罐培养种子罐内径400mm，高850mm，容积 150L、装料 70L，搅拌速度320r/ min。培养基配方为豆饼粉3%、山芋粉3%、麸皮 3%、Na:HPO.0.4%、KH:PO0.03%、豆油300mL、水60L，在0.1MPa下灭菌30min，培养温度29~31℃(低温季节30~32℃),酶活力在400~600U/mL较为合适。通风量保持在1:0.5VVM，自然pH。培养10h后镜检菌形，凡菌体瘦细、短而均匀者为优，发酵罐发酵发酵罐内径200mm，高2800mm，搅拌转速 220r/min，投料量1200L,接种量6%~8%，培养基配方为豆饼粉3.5%、玉米粉3%、山芋粉 3%、麸皮 2.5%， Na:HPO,0.4%、KH:PO,0.03%、豆油1000mL。培养温度按前期升温法培养，即在第5~8h内，每小时升温2℃，9~12h，每小时降温 2℃。第12h后保持30~32℃。通风量0~12h为1:0.6VVM:12~20h为1:0.7VVM: 20h后为1:0.8VVM，搅拌转速320r/min。发酵26-

项目九 典型发酵产品的生产 213

sh,酶活力6000-7000U/mL.pH5.5左右、总糖约为L.5%，残糖为0.5%以下。

酶的提炼与产品标准化向发酵液加入CaCl0.4%.pH6.0--7.0、搅拌30min,压去除杂质，清液用薄膜蒸发器在35~40℃,直空度9.6x10*-9.9x10Pa下浓缩至原体积的1/2以下,再加工业硫酸铵至浓度42%，盐析12-16h，除去上清液后，加硅藻土现,经离心分离或压滤，取出酶泥,绞碾成细条,置直空度9.6X10*~9.9x10Pa35℃千崇之后，磨粉即为成品,成品酶活力为10x10U/g左右,总收率约55%。1:发酵液可得到酶粉约16kg,

原酶粉常需添加填料，以制得酶活力均一的酶制剂，填料应选用不损害酶的活性、不吸湿、又不影响使用的材料。如CaCO、淀粉、乳糖、明胶、硅藻土、NA:SO.NaCI. MRO、NaHCO等均是工业上常用的填料。

⑤液体酶的制备 将发酵液过滤后，用刮板薄膜蒸发器，在35~40℃，真空度约8.5X10Pa，浓缩3倍后，在酶的稳定pH(6.5~7.0)下，添加15%NaCI和2%乙醇，置密闭容器内(以减少氧化引起的失活)，低温下可保存数月，

3.碱性蛋白酶生产

地衣芽孢杆菌2709液体深层培养法生产碱性蛋白酶是国内最早(1971年)投产的碱性蛋白酶，也是最大的一类蛋白酶，其产量占商品酶制剂总量的20%以上，此酶主要用于加酶洗涤剂制造及制革和丝绸脱胶。以下介绍其生产技术。

(1)工艺流程与中性蛋白酶生产相同。(2)操作要点

①菌种培养制培养基，接试管斜面菌种，于37℃培养24h后储藏于5℃冰箱备用。②种子培养种子培养是将斜面种子接入茄子瓶(培养基和养条件与斜面相同)后制成悬液，接入种子罐培养液中。种子罐(1000L)装500L种子培养基。在36℃下，通风量1:0.7VVM，搅拌速度为250r/min下培养18~20h。

③发酵 10000L发酵罐装培养基5000L在36℃下通风(前期1:1.5VVM，后期1:

0.2VVM) 搅拌 40h左右酶活力为8000~10 000U/mL。

④提取 地衣芽孢杆菌菌体细小，发酵液黏度大，直接采用常规离心或板框过滤法进行固液分离是困难的，而且也得不到澄清滤液。目前，国内一般工厂都采用无机盐凝聚的方法或直接将发酵液进行盐析。前者是向发酵液中加入一定量的无机盐，使菌体及杂蛋白聚集成大一些的颗粒，再进行压滤。此法虽能除去菌体，但过滤速度仍较慢，且色泽较深。后者是直接将发酵液进行盐析，得到酶、菌体、杂蛋白混合体系。

为解决上述问题，可采用絮凝法来处理发酵液，其做法是:向发酵液中加入碱式氯化铝，使终浓度为1.5%，然后用碱将发酵液pH调节到8.5左右，再加人聚丙烯酰胺，使终浓度为80mg/L,50r/min搅拌7min后，静置一段时间，然后在一定真空度下抽滤，向滤液中加入硫酸钠，使终浓度为55%，静置24h后，倾去上清液，加硅藻土2%，压滤干燥，磨粉，即为成品酶。

八、基因工程菌的发酵

近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产中。它不仅为人们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症一癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能;基因药物(胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原)、其他发酵产品(酶制剂、氨酸、酸、生素等已先后面市，基因工程产品大幅度降低成本。但是工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳