由于第一代基因工程产品都以大肠埃希菌作宿主

项目九 典型发酵产品的生产

1.制备含有人胰岛素基因的大肠埃希菌菌种

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克隆人胰岛素基因，并转入大肠埃希菌中，获得含有人胰岛素基因的大肠埃希菌菌种，(1)提取目的基因从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。

①鸟枪法用限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。进行筛选，可DNA分子杂交，即DNA探针。

人工合成法 根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。

③基因库从基因文库中提取，即从事先已经提取完毕的拿来用。④PCR扩增技术用于大量生产该段基因片段，以达到商业化运作。

(2)提取质粒从大肠埃希菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。此质粒将作为胰岛素基因的载体。

碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、 PCR 扩增、银染序列分析。

(3)基因重组 取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用 DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。

(4)将质粒转入大肠埃希菌在大肠埃希菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如 CaCl，这使细胞会吸收外源基因。此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠埃希菌便会将重组质粒吸收。

将大肠埃希菌用氯化钙处理，以增大大肠埃希菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进人受体细胞，此时的细胞处于感受态(理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态)。

经过以上步骤，可获得含有人胰岛素基因的大肠埃希菌菌种。

2.菌种扩大培养

将获得的大肠埃希菌菌种进行活化和斜面菌种扩培。

3.种子罐培养

在种子罐中对菌种进行进一步的扩大培养，至菌种到对数生长期时转入发酵罐培养。

4.发酵罐培养

分两阶段进行控制，第一阶段主要是通过控制溶解氧和补加甘油使菌体达到富集的目的，第二阶段是通过补加甲醇使菌体进行高密度表达目的产物，HPLC检测目的产物含量。

5.发酵液固液分离

目的产物存在于发酵上清液中，此步骤主要是控制目的产物收率。

6.P1(生长因子1启动子)纯化

通过两步柱色谱分离，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白，利用紫外检测仪控制目的产物收率，主要试剂为乙醇与异丙醇。

7.P1 (生长因子I启动子)沉淀、干燥

调节pH值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I固体。

8.P2(生长因子Ⅱ启动子)纯化

控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO与1.4-丁二醇，再通过柱色谱进行提纯，主要试剂为异丙醇。

9.P2(生长因子Ⅱ启动子)沉淀、干燥

调节pH值，使P2沉淀，再经离心干燥，得中间体Ⅱ固体。

 218 发置酵夏丝置米

图9:59 自动取样装置

1 培养罐:2-系;3 无菌水贮罐:4一污水贮箱:5-冷库

养结束即可直接输送培养液。如果排液口未与下段工序相连，则应与连接废液灭菌罐的排水管道相接，这样就安全了，

3.基因工程产品的提取和精制

传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同，主要表现在以下两方面。①传统发酵产品多为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高，提取方法较育单)，其理化性能,如平衡关系等数据均已知，因此放大比较有根据;相反，基因工程产品都是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。

②基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增加了很多困难。由于第一代基因工程产品都以大肠埃希菌作宿主，无生物传送系统，故产品处于胞内，而且发酵液中产物浓度也较稀，杂质又多，加上一般大分子较小、分子不稳定(如对剪切力)，故提取较困难，常需利用高分辨力的精制方法，如色谱分离等，在其他方面，基因工程产品的提取方法与传统发酵产品相似。

目前认为，基因工程产品的回收率达到30%~40%就已相当不错。因此，尽量减少提取步骤是相当重要的。

另外，对于基因工程产品，还应注意生物安全问题，即要防止菌体扩散，特别是对前面儿步操作，一般要求在密封的环境下操作。例如用密封操作的离心机进行菌体分离时，整个机器处在密团状态，在排气口装有一无菌过滤器。同时有一根空气回路以帮助平衡在排放固体时系统的压力，无菌过滤器用来排放过量的气体和空气，但不会使微生物排放到系统外。(二)胰岛素生产

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激面分泌的一种蛋白质激素，是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋自质合成的素，其作用机理属于受体酪氨酸酶机制。

早期胰岛素的来源是从牛胰脏提取，产量有限。用化学方法人工合成胰岛素仅有科学意义而无实用价值，因为成本太高。美国在1978年又用大肠埃希菌生产出了胰岛素，使胰岛素可以工业化生产，给糖尿病患者带来了福音，生产过程如下所述。